操作方法
一、细胞的裂解 1. 用包含调节因子的培养基按所需的时间处理细胞。 2．吸去培养基，用PBS缓冲液漂洗培养细胞两次，然后彻底吸除PBS。 3. 加入1 × SDS载样缓冲液(6孔板每孔用100 µl或10 cm2盘用500 µl)裂解细胞。立即刮取裂解液转入微离心管，置于冰上。 4. 超声波处理10－15秒以剪切DNA和减少样本的粘性。室温下10000 × g 离心10分钟。将上清转至一新的离心管。 5. 测定蛋白的浓度。将20 µl样本煮沸5分钟，置于冰上冷却。
二、小型胶槽中样本蛋白的电泳 1. 加样至胶孔，注意使用蛋白参照物（10 µl Bio-Rad多带的已染色标准参照物）。 2. 恒定电流（35-37 mA，设置电压大于300 V）电泳约2.5小时。
三、组装转膜卡盒 1. 电泳完成后，卸下胶块，将其于室温下放入转移缓冲液中30分钟。 2. 将转移缓冲液加入一足够容纳塑料转膜卡盒的盘中，使卡盒浸入其中，并组装转膜装置。 3. 卡盒的底部放置Scotch-Brite垫或海绵，其上放置一片转移液浸湿的与胶块等同大小的滤纸。 4. 将胶置于滤纸上，凝胶与滤纸接触的面最终将面向负电极。驱除胶与滤纸间的气泡。 5. 剪制一片与胶块大小相仿的转移膜，使膜的边缘超出胶1-2 mm。将膜先置在蒸馏水（硝酸纤维素膜）或甲醇中（PVDF膜）浸湿，再将其置于转移缓冲液中浸泡5分钟。 6. 将浸湿的转移膜置于胶面上，驱除胶与膜间的气泡。 7. 于转移膜上再放置一片浸湿的滤纸，赶净气泡。再放置另一块Scotch-Brite垫或海绵垫于滤纸上。 8. 将卡盒顶半部锁紧，完成组装。
四、蛋白从胶转移至膜 1. 按正确方向将卡盒放入装满转移液的转移槽内。 2. 用冷却的方式以100 V电泳转移蛋白30-60分钟，或于冷却室内14 V 稳压下电泳过夜。 3. 从杂交装置卸下膜，用软头铅笔或记号笔标记方位。
五、丽春红S或印度墨水染色(可选项) 1. 将膜放入盛有丽春红S工作液的盘内，轻摇孵育5-10分钟。 2. 蛋白带显色后，用去离子水在室温下洗涤数次。
六、封闭膜 1. 室温下将膜放入10 ml封闭液中(0.1 ml/cm2)，于摇床上轻摇1-2小时。 2．用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
七、目的蛋白与一抗的结合 1．将一抗（适当的稀释）加入10 ml一抗稀释缓冲液，膜置于其中并于室温轻摇2小时或4ºC过夜。 2. 用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
八、与二抗孵育 1．将与HRP结合的二抗（1：5000）加入10 ml封闭液中，置于膜室温下轻摇1小时。 2. 用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
九、蛋白的检测 1．室温下用10 ml LumiGLO温育并轻摇膜1分钟。 2. 倒尽冲洗液，注意勿让膜干燥，将膜用塑料膜包裹并暴露于X光片。最初曝光10秒可提示恰当的曝光时间。 * 由于检测反应的动力学，LumiGLO温育后即刻信号最强，随后的2小时逐渐减弱。