操作方法
配制所需的溶液: a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S; b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO;
将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀;
取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液;
2,000rpm,20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层;
PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗;
加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板;
细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。